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    CD161,踟躕在成藥的十字路口(上)
    2021-04-20 訪問次數:166

    ? ? ? ?近期“生物世界”的一篇原創文章,介紹了Cell在今年2月15日發布的“Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis”(圖1)。這篇論文的高光之處在于,單細胞在組織內成像的技術,實現了單細胞級別的蛋白表達檢測。并且,文中提出了類似于免疫治療的思路,將CD161視為潛在的治療靶點,阻斷CD161以激活細胞毒性T細胞(圖2)。


    圖1 Cell最近發布的關于CD161的文章。高光之一:高技術,單細胞級別檢測CD161在T細胞的表達,這些T細胞滲透進入了神經膠質瘤組織。

    圖2 高光之二:證明機制,具有細胞毒性的T細胞,也表達多種NK細胞受體。其中NK細胞表達的抑制型受體CD161,在T細胞也有表達,通過結合免疫調節細胞表達的CLEC2D,體現抑制活性。通過阻斷CD161與CLEC2D的結合,可以激活T細胞的活性。

    一、給你一張過去的CD
    ? ? ? ?CD161,別名NKRP1A(NK受體P1A)、KLRB1、CLEC5D,以下均稱為CD161。其中,KLRB1(killer cell lectin-like receptor subfamily B1)是推薦的名稱,中文翻譯為“殺傷細胞的類凝集素受體亞家族B成員1號”。CD161目前只發現一種序列,沒有其他變體。
    ? ? ? ?LLT1,別名CLEC2D(前言的Cell所稱),以下均稱為LLT1,作為CD161的配體。LLT1(lectin-like transcript 1)為CLEC2D的1號變體,中文翻譯“類凝集素轉錄體1”。這意味著CLEC2D存在多個變體,其中只有變體1,即LLT1,具有結合CD161的能力,且能夠激活下游信號。其他變體,比如變體2、4,不結合CD161。
    ? ? ? ?CLEC,C-type lectin domain family,可見CD161和LLT1同屬于這個大家族,分屬不同的亞家族。
    ? ? ? ?CD161和LLT1的表達
    ? ? ? ?CD161主要表達于粒細胞,以及單個核細胞的表面(圖3A),表達特異性較好。單個核細胞,包括NK細胞和T細胞,其中T細胞包括Th17、NK T、記憶T細胞,但不包括原始T細胞(圖3B)。另外,IL-17的表達與CD161的表達有極大的相關性,比如CD4+ TCRαβ+、CD8+ TCRαβ+、CD4-CD8- TCRαβ+、CD4-CD8-TCRγδ+等產生IL-17的細胞,它們存在CD161表達。另外,CD161+的細胞,IL-23R和RORC的表達量顯著高于CD161-的細胞。
    ? ? ? ?LLT1主要表達在小腸的派爾淋巴結,以及粒細胞、淋巴細胞(包括B細胞、T細胞、NK細胞)、扁桃體、肺、腎上腺、腎等部位(圖3C)。外周循環的B細胞、T細胞、NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞,在靜息狀態下,不表達LLT1,但是激活后,比如TLR(toll-like receptor)激活的類漿細胞、單核細胞衍生的樹突狀細胞、激活的B細胞,都一定程度地表達LLT1,對NK細胞有抑制作用,但對T細胞具有激活作用。

    圖3A,CD161在粒細胞和單個核細胞中高表達,主要在淋巴組織表達,摘自bgee.org。

    圖3B,CD161的表達情況,分別在患者的上皮組織內淋巴細胞(灰)、肝淋巴細胞(白)、外周血淋巴細胞,分別是大約75%、60%、20%。其中,上皮組織內的CD3+CD161+陽性的天然T細胞,顯著高于CD3-CD161+的NK細胞。

    圖3B,LLT1在小腸的派爾淋巴結高表達,主要在淋巴節和粒細胞表達,摘自bgee.org。
    ? ? ? ?CD161和LLT1的信號通路
    ? ? ? ?CD161在NK細胞上,作為抑制型受體,通過與其配體LLT1(CLEC2D)的結合,抑制NK細胞的細胞毒性,抑制IFN-γ的釋放(圖4A)。也有研究表明,在T細胞上,尤其是Th17上,CD161可作為其細胞亞群標記,為激活型受體,激活Th17表達和分泌IL-17(圖4B)。也可以通過TCR信號通路激活T細胞,促進IFN-γ的釋放。

    圖4A,NK細胞機制。LLT1表達在特殊的腫瘤組織中,比如三陰性乳腺癌(TNBC)、前列腺癌、B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞。表達于腫瘤細胞表面的LLT1,與NK細胞表達的CD161結合,給出抑制信號,降低其細胞毒性。LLT1在部分腫瘤組織中高表達,以抑制NK細胞的殺傷。

    圖4B,T細胞機制。神經磷脂酶(ASM),調節CD39和CD161的細胞內信號,并促使Th17的增殖。在Th17分化條件下,CD4+ T細胞內,MHC/CD3/CD28,以及IL-6的刺激信號,激活mTOR和STAT3信號。同時,CD39和CD161的刺激信號進一步增強了上述信號,最終導致Th17增殖,以及分泌IL-17。
    ? ? ? ?CD161的胞內區并沒有NK細胞受體常見結構域的ITIM,即“免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體”,或ITAM,激活性模體。因此,CD161激活后的下游信號,不同于常見的NK細胞受體激活模式,并且在NK、T細胞中可能產生了不同的結果:一方面,胞內域通過與CD39的結合,激活神經磷脂酶(ASM、SMPD1),通過STAT3、mTOR等通路,上調細胞內神經酰胺的表達;另一方面,激活AKT1/PKB和RPS6KA1/RSK1激酶和下游信號,這與通過CD3激活T細胞的通路一致。
    ? ? ? ?研究表明,CD161的表達,受IL-12調控,依賴于IL-12作用時間和劑量。IL-12可提高NK細胞表面的CD161,進而抑制NK細胞活性,這是一個負反饋的過程。另一方面,IFN-β可導致CD161表達降低。?
    ? ? ? ?CD161和LLT1的結構和修飾
    ? ? ? ?CD161是一種二型的穿膜糖蛋白,存在3對鏈內二硫鍵,以及1個N糖基化位點(圖5)。
    ? ? ? ?LLT1也是一種二型的穿膜糖蛋白,存在2對鏈內二硫鍵,以及2個N糖基化位點(圖5)。
    ? ? ? ?二型的穿膜蛋白,即N端為胞內域,C端為胞外域。

    圖5 CD161的結構信息,摘自Uniprot.org。CD161全長為225個氨基酸,保外域為67~225,其中含有3對鏈內二硫鍵,并存在1個N糖基化位點。

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    圖6 LLT1的結構信息,摘自Uniprot.org。LLT1全長為191個氨基酸,保外域為103~184,其中含有2對鏈內二硫鍵,并存在2個N糖基化位點。
    ? ? ? ?考慮到如果我們篩選一種阻斷CD161-LLT1結合的抗體,N糖基化如果影響了表位的構象,那么抗體的結合也會受到N糖基化的影響。如果付諸于行動,這個修飾的問題是無法繞開的。

    二、迷失自我的狂歡
    ? ? ? ?從CD161在NK細胞上的調控模式看,存在順式作用(NK細胞能在某種刺激條件下,同時表達CD161和LLT1,抑制自身活性)、反式作用(B細胞、T細胞、樹突狀細胞表達LLT1,從而抑制NK細胞)。阻斷CD161-LLT1的結合,可以增強NK細胞的細胞毒性,釋放IFN-γ。
    ? ? ? ?另一方面,CD161+CD8+的T細胞,被分類為組織追蹤MAIT(粘膜相關不變T細胞),細胞毒性Tc17細胞,或者記憶T細胞,具有組織追蹤和增強的細胞毒性。記憶細胞可以對病毒感染、細菌感染、抗原呈遞細胞的刺激做出響應,進而上調細胞因子,比如INF-γ、IL-17,釋放顆粒酶。
    ? ? ? ?利用NK細胞的免疫檢查點機制,對NK細胞的抑制解除,以及激活,是一種新的免疫治療的前沿。我在之前的文章(https://mp.weixin.qq.com/s/5bWB41CAyKXi0348XTtIHw),總結了NK細胞作為免疫治療的新方向,列舉了一些NK細胞的激活或抑制型受體。比如激活型的KIR2DS、NKp80、NKp46/44/30、NKG2C/D/E、DNAM-1、CD16a,抑制型的KIR3DL、NKG2A/CD94、CD161/LLT1、PD-1、TIGIT、CD96、LAG3等(圖7、8)。

    圖7 NK細胞表面的抑制型受體(紅)和激活型受體(綠)。ITIM,immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs,免疫受體中基于酪氨酸的抑制型模體;ITAM,immuno-receptor tyrosine-based activation motifs,免疫受體中基于酪氨酸的激活型模體。KIR,killer Ig-like receptor,殺手細胞類免疫球蛋白受體。

    圖8 NK細胞受體的分類。在NK細胞上,順式結合的CD161和LLT1,與MHC-I結合,抑制其活性。
    ? ? ? ?NK細胞,占PBMC的5~10%,與CD8+ T細胞,有類似的殺傷活性(cytotoxicity),但是細胞的標記物與CD8+ T細胞有顯著差異,不表達CD3和TCR。NK細胞的抗原特征為CD56+CD3-,其中85%~95%的NK細胞為CD56dim(暗)CD16ahigh,主要是成熟的殺傷細胞,高表達KIR,可分泌穿孔素和顆粒酶,剩余的為CD56bright(亮)CD16alow,有未成熟的NK細胞,低表達KIR和NKG2A/CD94。NK細胞的分類中,還包括抗原呈遞NK(APNK)、輔助NK(NKh)、調節NK(NKreg)。
    ? ? ? ?與T細胞需要抗原呈遞的過程不同,細胞毒性NK細胞是天然免疫系統的一部分,不需要抗原呈遞,組織相容性復合體(MHC)I類復合體與NK細胞結合,通常激活抑制型的受體(含ITIM,圖7),抑制了NK細胞的活性,這也是組織細胞避免被NK細胞殺傷的機制。在一部分腫瘤組織中,腫瘤細胞雖然下調了MHC-I的表達,規避了T細胞的識別,但因為MHC下調激活了NK細胞的活性,補充了T細胞的不足。
    ? ? ? ?NK細胞的殺傷機制,稱為“missing self”,即“迷失自我”。也有研究表明,MHC-I可激活NK細胞(圖8)。因此,NK細胞的殺傷活性,基于抑制和激活信號的平衡。
    ? ? ? ?因此,如果不考慮腫瘤內環境的惡劣、腫瘤細胞對NK細胞的塑造、調節型細胞的抑制的話,類比NKG2A/CD94,我們也可以將CD161/LLT1加入到這一場NK細胞“迷失自我的狂歡”中。目前,關于NK細胞的抗體(BiKE、TriKE),或者CAR-NK的臨床實驗,也在如火如荼進行中,也可以給我們一些借鑒。
    ? ? ? ?然而,我們不能過于樂觀地估計NK細胞的殺傷,除了血液淋巴瘤,還有腫瘤微環境的巨大挑戰:
    ? ? ? ?1. 抑制信號,包括抑制型受體介導的(圖7、8),以及抑制型細胞因子,比如TGFβ、IL-10;
    ? ? ? ?2. 抑制細胞,Treg、NKreg、骨髓瘤衍生抑制型細胞(MDSC)、基質細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞;比如,Treg細胞、MDSC細胞表達TGFβ,結合NK細胞的TGFR2,從而下調其表面的NKG2D、NKp30這些激活型受體,使其被激活的能力降低;
    ? ? ? ?3. 浸潤能力,在非小細胞肺癌(NSCLC)中,未檢測到NK細胞亞群,但是存在CD161+CD4+、CD161+CD8+的T細胞。在結直腸癌中,幾乎完全排除NK細胞的浸潤;
    ? ? ? ?4. 腫瘤微環境中,缺氧、低糖,顆粒酶B的半衰期顯著降低。
    ? ? ? ?我們可以通過IL-12、IL-15、IL-18,是NK細胞聚集在腫瘤組織并維持活性。然而,IL-12促進CD161的表達,進而抑制NK細胞的活性。IL-15具有促進NK細胞增殖和殺傷活性的能力,但是單獨使用,并不能維持NK細胞的滲透能力。

    三、小結
    ? ? ? ?本期推送,我們給大家介紹了CD161和LLT1,并且講述了CD161在NK細胞上的調控模式以及腫瘤微環境的巨大挑戰。下一期中,我們會接著帶來CD161成藥性的挑戰以及CD161在T細胞尤其是CD8+的T細胞的病理機制。


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